Xét nghiệm sinh hóa nước tiểu

Xét nghiệm sinh hóa nước tiểu là một xét nghiệm thường quy, phổ biến cho bệnh nhân, rất quan trọng trong việc chẩn đoán các bệnh lý đường tiết niệu.

I. ĐẠI CƯƠNG XÉT NGHIỆM SINH HÓA NƯỚC TIỂU

–  Xét nghiệm nước tiểu, máu, và dich tiết (hay xuất tiết) đường niệu sinh dục rất quan trọng trong chẩn đoán các bệnh tiết niệu.

– Phân tích nước tiểu có 5 tiêu chí để có thông tin chính xác:

1. Thu thập mẫu đúng cách
2. Mẫu XN cần được làm ngay sau khi lấy
3. XN toàn diện: phân tích tính vật lí, hóa học (dipstick) và phân tích vi thể .
4. Kinh nghiệm BS – KTV xét nghiệm
5. Đánh giá đúng các kết quả.

– Phân tích nước tiểu nhanh, đơn giản bằng các que dipstick cho các thông tin cần thiết.

– Phân tích nước tiểu thường quy ở tất cả các bệnh nhân nhập viện không có triệu chứng niệu thì không được khuyến cáo (Godbole and Johnstone,2004).

– Các BN có triệu chứng đường niệu cần phải phân tích nước tiểu. Nếu XN nước tiểu đại thể (dipstick) bình thường thì các phân tích vi thể thường không cần thực hiện tiếp. Nếu XN dipstick (+) với protein , heme , leukocyte esterase, hay nitrit, thì XN vi thể về cặn lắng là rất cần thiết (Simerville,Maxted, and Pahira, 2005).

 II. THU THẬP MẪU NƯỚC TIỂU:

1. Thời gian lấy mẫu nước tiểu

– Mẫu nước tiểu đầu tiên vào buổi sáng:

+ Định lượng protein niệu ở bệnh nhân có protein niệu theo tư thế

+ Đánh giá tỷ trọng

– Mẫu nước tiểu lấy sau ăn hay sau khi đứng trong vài giờ có độ kiềm,  có thể chứa hồng cầu ly giải, các trụ bị phân hủy, hay thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. Vì vậy, các mẫu nước tiểu này cần được phân tích ngay sau khi lấy trong vòng 1 giờ.

– Nước tiểu ở các bệnh nhân trong tình trạng thiếu nước làm thay đổi độ cô đặc nước tiểu.

2. Phương pháp thu thập nước tiểu

– Cách lấy mẫu đúng rất quan trọng đặc biệt ở các BN cần đánh giá tiểu máu, protein niệu, nhiễm trùng tiểu. Cách lấy phải đồng nhất ở các phòng xét nghiệm.

– Lấy mẫu nước tiểu liên tục nhiều mẫu trong 1 lần đi tiểu có thể giúp xác định nơi tiểu máu hay nhiễm khuẩn trên đường niệu.

– Lấy mẫu nên được thực hiện trước các thăm khám niệu sinh dục, trực tràng nhằm tránh thâm nhiễm từ trực tràng, các chất tiết của tiền liệt tuyến do đè ép.

– Không nên lấy  nước tiểu được qua bao cao su, sonde tiểu, hay túi chứa từ ống dẫn lưu nếu không thật sự cần thiết.

2.1. Đối với bệnh nhân nam giới

– Thường lấy nước tiểu giữa dòng để loại trừ phần lớn sự thâm nhiễm dịch tiết từ miệng niệu đạo và niệu đạo.

– Bảng thủ thuật lấy nên được dán ngay chổ BN lấy nước tiểu với các bước sau:

1	Kéo bao da qui đầu lên (thường nhiễm khuẩn) và lau sạch miệng niệu đạo với benzalkonium chloride hay hexachlorophene.
2	Tiểu bỏ khoảng 15- 30 ml nước tiểu đầu tiên
3	Lấy phần nước tiểu tiếp sau đó (lây khoảng 50 – 100ml) vào bình chứa nước tiểu vô trùng, và đậy nắp ngay sau khi lấy xong
4	Tiểu hết phần nước tiểu còn lại

– Phần nước tiểu sẽ được khảo sát về vi thể và đại thể và phần còn lại sẽ được giữ lại cho các XN tiếp theo khi cần.

– Ở nam giới, nếu có bí tiểu có thể lấy mẫu qua thông tiểu.

2.2. Đối với bệnh nhân nữ giới

– Phương pháp tốt nhất để thu thập mẫu nước tiểu giữa dòng theo bảng sau:

1	BN nằm trên bàn khám theo tư thế sản khoa
2	Miệng niệu đạo và vùng sinh dục được rửa sạch bằng dung dịch benzalkonium chloride hay hexachlorophene
3	Tách 2 môi nhỏ ra
4	Sau khi BN tiểu bỏ 15- 30 ml, lấy bình chứa lấy nước tiểu tiếp theo khoảng 50 – 100 ml, và đậy nắp bình chứa ngay khi lấy xong
5	BN tiểu bỏ hết phần còn lại

– Tuy nhiên BN có thể tự lấy nước tiểu giữa dòng  và xét nghiệm nếu kết quả bình thường thì không cần thực hiện phương pháp trên. Nhưng nếu mẫu nước tiểu bất thường hay có nghi ngờ thì cần phải được thực hiện theo chuẩn trên để có kết quả chính xác nhất.

– Có thể lấy mẫu bằng ống thông nếu không thể lấy mẫu được theo các phương pháp trên. Với thông tiểu, có thể đánh giá nước tiểu tồn lưu, hay loại trừ nguồn chảy máu từ âm đạo.

2.3. Đối với bệnh nhân trẻ em

– Với phân tích nước tiểu không phải tìm khuẩn niệu có thể dùng 1 túi vô khuẩn đặt bao phủ vùng miệng niệu đạo sạch để lấy mẫu nước tiểu.

– Với phân tích nước tiểu tìm khuẩn niệu, nên lấy mẫu nước tiểu bằng ống thông hay dùng kim chọc trên xương mu. Ở nữ có thể dùng ống thông nhỏ lấy nước tiểu, nhưng ở nam không nên lấy thường qui bằng thông tiểu. Cách được dùng cho cả trẻ nam và nữ  thường là qua đường chọc kim trên xương mu, theo cách sau:

1	Làm sạch vùng trên xương mu với Alcohol
2	Gây tê trong da ở đường giữa ngay trên xương mu 1- 2cm (BQ nằm ngay trên xương mu ở trẻ nhỏ)
3	Dùng kim số 22 + ống tiêm 10ml, đâm thẳng góc qua thành bụng vừa đâm vừa rút nhẹ nhàng, khi kim vào BQ nước tiểu sẽ lấy được.

III. PHÂN TÍCH TÍNH CHẤT VẬT LÍ NƯỚC TIỂU

Phân tích gồm các tính chất sau: màu sắc, độ đục, tỷ trọng và nồng độ thẩm thấu, và PH

1. Màu sắc

– Bình thường nước tiểu có màu vàng nhạt do sự hiện diện của urochrome. Màu sắc nước tiểu thay đổi tuỳ theo nồng độ, và có nhiều thức ăn, thuốc, các sản phẩm dị hoá, tình trạng viêm nhiễm… thay đổi màu sắc nước tiểu.

– Nước tiểu có màu do 1 số thuốc như: Phenozopyridine (pyridium) – màu cam; Rifampin – màu vàng cam; Nitrofurantoin – màu nâu ;L-dopa, α-methyldopa, Metronidazol – màu nâu đỏ

– Nước tiểu màu đỏ không phải luôn là tiểu máu. Loại trừ tiểu máu ở mẫu nước tiểu màu đỏ bằng phân tích vi thể.Sự đổi màu đỏ của nước tiểu không có hồng cầu có nhiều nguyên nhân do bài tiết các chất như:

+ Chất betacyanin sau khi ăn củ cải đường

+ Chất Phenolphthalein: thuốc nhuận trường, các rau quả có màu, nước tiểu cô đặc.

+ Chất myoglobinuria: do chấn thương cơ

+ Chất hemoglobinuria: do ly giải máu.

+ Vi khuẩn Serratia marcescens có thể gây hội chứng “red diaper” (băng vệ sinh đỏ).

Không màu	– Quá loãng – Thừa nước
Cloudy/milky (đục- sữa)	– Phosphaturia – Tiểu mủ – Tiểu dưỡng chấp
Đỏ	-Tiểu máu -Hemoglobinuria/myoglobinuria -Anthrocyanin in beets and blackberries (củ cải đường, quả mâm sôi) -Chronic lead and mercury poisoning (chì – thuỷ ngân) -Phenolphthalein (in bowel evacuants) -Phenothiazines (e.g., Compazine) -Rifampin
Vàng cam	-Mất nước -Phenazopyridine (Pyridium) -Sulfasalazine (Azulfidine)
Vàng	-Bình thường -PhenacetinRiboflavin
Xanh lá cây –  xanh dương	BiliverdinIndicanuria (tryptophan indole metabolites) Amitriptyline (Elavil) -Indigo carmine -Methylene bluePhenois (e.g., IV cimetidine [Tagamet],IV promethazine [Phenergan]) -ResorcinolTriamterene (Dyrenium)
Nâu	-Urobilinogen -PorphyriaAloe, fava beans, and rhubarb -Chloroquine and primaquine -Furazolidone (Furoxone) -Metronidazole (Flagyl) -Nitrofurantoin (Furadantin)
Nâu – đen	-Alcaptonuria (homogentisic acid) -Hemorrhage -MelaninTyrosinosis (hydroxyphenylpyruvic acid) -Cascara, senna (laxatives) -Methocarbamol (Robaxin) -Methyldopa (Aldomet) -Sorbitol

2. Độ đục (Turbility)

– Thường do (1) Tiểu mủ; (2) Tiểu nhiều phosphate không kết tinh: mất màu đục khi cho vào acid hay urate.

 – Nước tiểu bình thường trong.

– Nước tiểu đục:

+ Phosphaturia: Nước tiểu đục nguyên nhân nhiều nhất do phosphat niệu (khi có nhiều phosphate crystals trong nước tiểu kiềm). Phosphate niệu ngắt quãng và thường xuất hiện sau ăn hay uống nhiều sữa. Bệnh không có triệu chứng, được chẩn đoán bằng nhỏ acid acetic là nước tiểu trong lại ngay, hay bằng phân tích vi thể tìm phosphate crystals.

+ Tiểu mủ: thường xuất hiện với nhiễm trùng niệu, có 1 lượng lớn bạch cầu trong nước tiểu. Để phân biệt với phosphaturia, mùi của nước tiểu mủ hôi và bằng phân tích vi thể có bạch cầu.

+ Tiểu dưỡng chấp (chyluria) hiếm gặp, do có sự thông thương giữa hệ thống bạch huyết và đường niệu.

+ Các nguyên nhân khác:Tiểu mỡ (lipiduria), tăng oxalate niệu (hyperoxaluria), và tăng uric niệu (hyperuricosuria)

3. Tỷ trọng và nồng độ thẩm thấu

3.1. Tỷ trọng nước tiểu

– Dễ dàng xác định bằng que dipstick, bình thường 1.001 – 1.035. Tỷ trọng nước tiểu phản ánh tình trạng mất nước nhưng cũng có thể do thay đổi chức năng thận, hay số lượng các chất hoà tan trong nước tiểu,…Tỷ trọng nước tiểu < 1.008 có thể xem là pha loãng và trên 1.020 được coi là cô đặc. 1 tỷ trọng cố định 1.010 có thể là dấu hiệu suy thận, cả cấp và mãn.

Các điều kiện làm giảm tỷ trọng nước tiểu	Các điều kiện làm tăng tỷ trọng nước tiểu
(1) Tăng lượng dịch vào cơ thể (2) Lợi tiểu (3) Giảm chức năng cô đặc của thận (4) Tiểu đường (thẩm thấu)	(1) Giảm lượng dịch vào cơ thể (2) Mất nước do sốt, đỏ mồ hôi, ói, tiêu chảy (3) Hormone chống bài niệu tăng (4) Tiểu đường (tăng glucose niệu)

– BN với chấn thương sọ não có thể thấp do thiếu hormone chống bài niệu (vasopressin)

– BN tiểu đường tỷ trọng thường thấp < 1.010.

– BN có tổn thương ống thấn cấp tỷ trọng nước tiểu  gần bằng với tỷ trọng huyết tương 1.010. Tỷ trọng nước tiểu thấp có thể là dấu hiệu sớm của tổn thương ống thận do 1 số nguyên nhân (vd: bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm).

– Đánh giá mất nước sau phẫu thuật.

– Tác động lên kết quả 1 số xét nghiệm khác: ở nước tiểu pha loãng XN thai có thể âm tính, ngược lại với nước tiểu cô đặc cho kết quả XN protein niệu dương tính giả với dipsticks, nâng giả mức đường niệu, protein niệu…

3.2. Nồng độ thẩm thấu (Osmolality

– Được đo bằng lượng chất hoà tan trong nước tiểu và thường khác nhau từ 50 – 1200 mOsmol/L. Không thể đo bằng que dipstick.

– Thay đổi khi mất nước, và  các yếu tố làm tăng giảm cũng tương tự như tỷ trọng nước tiểu

– Phản ánh chức năng thận tương tự tỷ trọng

4. PH

– Bình thường 4.5 – 8, PH<5.5 được coi là acid, PH>6.5 được coi là kiềm.

– PH thay đổi rẩt nhanh khi tiếp xúc với không khí, nên cần XN ngay bằng dipstick.

– Về cơ bản, PH nước tiểu phản ánh PH huyết thanh, nhưng có 1 ngoại lệ:

+ Acidosis ống thận (renal tubular acidosis (RTA)): nước tiểu thường có độ kiềm dù có lượng acid trong nước tiểu, do trong nước tiểu có nhiều HCO3^–

+ Với RTA type II nặng (ống thận gần): nước tiểu có thể đôi khi có acid nhưng vẫn thường kiềm; Nhưng với RTA type I nặng (ống thận xa) thì lúc nào cũng kiềm.

– PH nước tiểu quan trọng ở vài trường hợp lâm sàng. BN có sỏi uric acid nước tiểu thường acid (hiếm khi PH nước tiểu > 6.5). BN có sỏi calcium, vôi hóa thận (nephrocalcinosis), acid ống thận nước tiểu thường kiềm (hiếm khi PH<6.0) . Với nhiễm trùng niệu do vi khuẩn phân giải urea (thường nhất là chủng Proteus), PH nước tiểu thường > 7.0.

– Nước tiểu lấy sau ăn no (<2giờ) hay đứng lâu trong nhiều giờ có khuynh hướng kiềm. Giấy chỉ thị (dipstick) thường khá chính xác.

IV. PHÂN TÍCH TÍNH CHẤT HÓA HỌC NƯỚC TIỂU:

1. Que Dipsticks (dip-strip)

– Là phương pháp nhanh và rẻ để phát hiện các thành phần bất thường trong nước tiểu. Dipsticks là những dải ngắn, bằng nhựa với miếng marker nhỏ được thấm các chất thử mà cho phản ứng với các chất bất thường trong nước tiểu làm thay đổi màu sắc que đo. Các chất bất thường mà dipstick thường được dùng gồm: (1) Máu, (2) Protein, (3) Glucose, (4) Ketones, (5) Urobilinogen và bilirubin, (6) Bạch cầu, (7) Tỷ trọng, (8) PH, và (9) Nitrites.

– Các chất có trên bảng 1 làm thay đổi màu sắc nước tiểu, có thể ảnh hưởng đến biến đổi màu trên que dipstick. Như chất Phenazopyridine làm nước tiểu đổi màu vàng cam sáng, ảnh hưởng đến kết quả màu sắc trên que thử dipstick.

– Vùng thuốc thử trên que phải được ngập hết trong mẫu, và sau đó rút ra tránh hoà tan thuốc thử vào nước tiểu, để thẳng đứng, chờ đọc và so sánh màu với bảng màu.

– Khi có nhiều acid ascorbic dùng dipstick:

+ Thử glucose niệu sẽ âm tính giả

+ Thử xác định tiểu máu thì không bị ảnh hưởng

 (Note trong Smith 17^th :có acid ascorbic trong nước tiểu sẽ ngăn chặn phản ứng dipstick gây kết quả âm tính giả.)

–  Khi nước tiểu kiềm:

+ Âm tính giả khi đọc tỷ trọng

+ Dương tính giả khi đọc protein niệu.

– Khi que hết hạn sử dụng, thuốc thử mất phần lớn tác dụng gây kết quả sai.

2 . Tiểu máu, Hemoglobin và Myoglobin:

– Test dipstick thì không đặc hiệu cho hồng cầu, nhưng nên làm để tầm soát tiểu máu, và phân tích vi thể cặn lắng sau đó được thực hiện sau đó.

– Dipstick dương tính khi trong nước tiểu có máu, hem, hemoglobin, hay myoglobin. Hóa chất phát hiện máu trong nước tiểu dựa trên hoạt động giống men peroxidase của hemoglobin. Khi tiếp xúc với chất nền peroxidase cơ quan, hemoglobin xúc tác phản ứng và gây oxy hoá liên tiếp lên chât chỉ thị màu, làm thay đổi màu sắc tuỳ theo mức độ và lượng oxy hóa. Độ thay đổi màu sắc liên quan trực tiếp đến lượng hemoglobin hiện diện trong nước tiểu. Nếu có hiện diện hemoglobin và myoglobin sẽ xúc tác thuốc thử trên que, làm thay đổi màu nhiều theo vùng trên que. Còn khi có hồng cầu, các hồng cầu sẽ bị ly giải và tiếp xúc thuốc thử trên từng vùng và không liên tục, nên gây biến đổi màu dạng chấm trên que.

– Nước tiểu bình thường chứa < 3 HC/ quang trường x40. Gây biến đổi que thử dạng chấm, khi có >250HC/mL, các chấm đổi màu sẽ kết dính lại với nhau.

– Phân biệt tiểu máu và tiểu hemoglobin và myoglobin bằng các phân tích vi thể cặn lắng nước tiểu, tìm hồng cầu. Nếu không có hồng cầu, phân tích huyết thanh giúp phân biệt hemoglobin và myoglobin.

+ Hemoglobin niệu: Lấy mẫu máu và quay ly tâm, phần nổi lên trên là màu hồng, do hemoglobin tự do trong huyết thanh kết hợp với haptoglobin – tan trong nước và có trọng lượng phân tử cao. Kết hợp này vẫn còn nằm trong huyết thanh, có màu hồng. Chỉ khi các vị trí kết dính với hapoglobin bão hoà, thì hemoglobin tự do mới xuất hiện trong nước tiểu.

+ Myoglobin niệu: Myoglobin được phóng thích từ cơ, có trọng lượng phân tử thấp và tan trong nước, không kết hợp với haptaglobin và do đó được  đào thải hết qua nước tiểu. Nên, nếu là myoglobin niệu thì phần dịch huyết thanh sẽ trong.

 Chú ý, với mẫu nước tiểu pha loãng (tỷ trọng < 1.008) gây ly giải hồng cầu trong nước tiểu và dương tính với phản ứng hemoglobin nhưng không thể nhìn thấy hồng cầu trong phân tích vi thể.

– Độ nhậy của dipstick niệu được xác định khi có > 3 HC/ quang trường x40 của mẫu cặn lắng nước tiểu với tỉ lệ là 90%. Độ chuyên của dipstick niệu  thấp, do có tỉ lệ dương tính giả cao ( Shaw et al, 1985 ).

– Các nguyên nhân dương tính giả của dipstick niệu trong phát hiện tiểu máu:

+ Thâm nhiễm máu kinh nguyệt.

+ Tình trạng mất nước dẫn đến tăng nồng độ của hồng cầu và hemaglobin. Ở người bình thường có khoảng 1000 HC/mL nước tiểu, và giới hạn bình thường trên là 5000- 8000 HC/mL (Kincaid-Smith, 1982 ). Do đó, khi tỷ trọng nước tiểu cao, như mẫu nước tiểu đầu buổi sáng, làm tăng khả năng dương tính giả.

+ Hoạt động thể lực nhiều gây tăng HC niệu sinh lý.

+ Các tác nhân oxy hóa

+ Men peroxidase vi khuẩn tiết ra.

3. Protein niệu

– Bình thường, ở người trưởng thành bài tiết 80 – 150 mg protein niệu hàng ngày. Bình thường protein niệu gồm có 30% albumin, 30% globulins huyết thanh, and 40% mô, phần lớn là Tamm-Horsfall protein. Điều này có thể thay đổi do tác động của đô lọc cầu thận, tái hấp thu ống thận, hay bài tiết protein niệu.

– Tăng protien niệu lâu >150mg/24h là dấu hiệu bệnh lý, định lượng protein niệu  và điện di nước tiểu để xác định loại protein niệu.

– Lượng protein niệu tăng có thể là:

+ Dấu hiệu bệnh thận ống thận mô kẽ, bệnh cầu thận hay bệnh mạch máu thận

+ Tăng lượng protein đến thận trong bệnh đa u tủy

+ Thứ phát sau các rối loạn ngoài thận hay đáp ứng với các điều kiện vật lý khác nhau, như hoạt động thể lực quá mức, sốt kết dài.

+ Protein niệu tư thế: tăng protein niệu nếu BN đứng trong 1 thời gian dài, trong khi trước đó có thể bình thường.

3.1. Bệnh sinh

-Hầu hết nguyên nhân protein niệu được chia ra 3 trường hợp: cầu thận, ống thận và tràn đầy (overflow).

– Protein niệu cầu thận: thường gặp nhất, do tăng tính thấm mao mạch cầu thận với protein, đặc biệt là Albumin, do các bệnh cầu thận (như bênh thận IgA) hay trong bệnh cầu thận kết hợp với bệnh hệ thống như tiểu đường. Khi lượng protein niệu 24h từ >1g , nên nghi ngờ bệnh cầu thận, và >3g gần như chắc chắn.

– Protein niệu ống thận: do không tái hấp thu các protein được lọc có trong lượng phân tử thấp như immunoglobin, protein niệu/ 24h ít khi vượt quá 2-3 g, và thường tăng bài tiết các protein có trọng lượng phân tử thấp hơn Albumin, thường kết hợp với các triệu chứng khác do kiếm khuyết của ống thận gần như: glucose niệu, aminoacid niệu, phosphate niệu, và uric niệu (Hội chứng Fanconi).

– Protein niệu tràn đầy: không có các bệnh của thận, nhưng so tăng nồng độ huyết tương của các immunoglobin bất thường và các protein trọng lượng phân tử thấp, điều này dẫn đến vượt ngưỡng độ lọc cầu thận và ngưỡng tái hấp thu ống thận. Nguyên nhân thường gặp là đa u tuỷ xương, tăng lượng immunoglobin chuỗi nhẹ và xuất hiện trong nước tiểu (protein Bence Jones).

3.2. Phát hiện

– Test dipstick có chất xanh bromphenol được dùng để xác định hiện diện của protein niệu > 20 – 30 mg/dL (theo Smith > 10mg/dL) , nhưng không nhạy với Bence-John protein.

+ Dương tính giả: khi nước tiểu cô đặc, do có chứa các tế bào bạch cầu (leukocytes) hay dịch tiết âm đạo với các tế bào biểu mô.

+ Âm tính giả: khi nước tiểu kiềm, nước tiểu pha loãng, và khi protein cơ bản không có Albumin (chỉ có Bence-John protein)

– Sự kết tủa của protein niệu với acid mạnh như sulfosalicylic acid 3% phát hiện priotein niệu ở nồng độ khoảng 15mg/dL và nhạy cảm phát hiện các protein khác, cũng như với Albumin. Bệnh nhân có dipstick niệu am tính với protein, nhưng có kết tủa nhiều với sulfosalicylic acid 3%  có thể là bệnh đa u tủy, và cần làm thêm để tìm Bence-John protein.

– Điện di protein: giúp phân biết protein cầu thận với protein ống thận. Protein cầu thận, Albumin chiếm khoảng 70%, trong khi với protein niệu ống thận Albumin chiếm 10-20%.

– Xét nghiệm miễn dịch là phương pháp tìm các protein đặc hiệu như Bence Jones protein.

3.3. Đánh giá

 Protein niệu nên chia theo thời gian: nhất thời, ngắt quãng, và dai dẳng.

– Protein niệu nhất thời: gặp thường nhất, đặc biệt ở trẻ, thường do sốt, hoạt động thể lực, hay stress. Ở người lớn có thẻ do suy tim sung huyết.

– Protein niệu ngắt quãng: thường liên quan đến tư thế (Robinson, 1985), tư thế đứng, protein niệu thường nhẹ và ngắt quãng ở người trẻ. Tổng lượng protein /24h hiếm khi vượt quá 1g, và protein niệu bình thường khi bệnh nhân nằm nghỉ. Nguyên nhân có thể do tăng áp suất tĩnh mạch khi đứng lâu. Chức năng thận bình thường.

– Protein niệu dai dẳng: cần tầm soát nguyên nhân,  thông thường do bệnh cầu thận, định lượng protein niệu 24 h, tìm thành phần protein niệu. Nếu do bệnh cầu thận thường kết hợp với tiểu máu có hồng cầu biến dạng và trụ hồng cầu, nếu không có kết hợp tiểu máu có thể kết hợp với các nguyên nhân khác mà thường nhất là tiểu đường, hay hiếm gặp hơn là thoái hóa dạng tinh bột (amyloidosis), hay xơ hóa tiểu động mạch thận.

– Ở BN có protein niệu 300 – 2000mg/24h, mà phần lớn là các protein có trọng lượng phân tử thấp, cân thực hiện điện di miễn dịch (immunoelectrophoresis) để xác định protein là bình thường hay bất thường:

+ Nếu là các protein bình thường: protein niệu ống thận

+ Nếu là các protein bất thường:  protein niệu tràn đầy, cần tìm Bence Jones protein.

4. Glucose và Ketones niệu

4.1 Glucose

– Dùng các test niệu tìm glucose và ketones tầm soát bệnh tiểu đường. Bình thường hầu như tất cả glucose được lọc qua cầu thận được tái hấp thu ở ống thận gần. Dù vậy có thể có 1 lượng rât nhỏ glucose tiết ra ngoài, thường dưới ngưỡng phát hiện của dipstick. Nếu lượng glucose lọc tăng quá ngưỡng hấp thu ống thận gần, glucose tăng trong nước tiểu. Đáp ứng ngưỡng thận với glucose huyết thanh là 180mg/dL.

– Test dipstick tìm men glucose oxidase-peroxidase khá chính xác và đặc hiệu cho phát hiện đường trong nước tiểu. Độ nhậy dipstick giảm khi tăng tỷ trọng và nhiệt độ nước tiểu.

– Kết quả dương tính giả có thể gặp ở BN uống aspirin, acid ascorbic, hay cephalosporins.

– Ở BN có đường huyết <180m/dL  nhưng có glucose niệu cao chứng tỏ ngưỡng thận bài tiết glucose thấp.

4.2 Ketones niệu

– Bình thường không thấy trong nước tiểu, chỉ xuất hiện khi cung cấp carbonhydrate cơ thể thiếu và mỡ cơ thể được huy động dùng. Điều này thường gặp trong nhiễm ketoacid tiểu đường, có thai và sau thời kỳ đói hay giảm cân nhanh.

– Ketones được tiết ra bao gồm acetoacetic acid, acetone, và β-hydroxybutyric acid.

– Dipstick có thể dùng cho ketones và glucose.

5. Bilirubin and Urobilinogen

– Bình thương nước tiểu có 1 phần rất nhỏ urobilirubin và không chứa bilirubin.

– Bilirubin trực tiếp: (do kết hợp với glucuronic acid  ở gan) có trọng lượng phân tử thấp và tan trong nước, và bình thường từ gan qua ống mật vào ruột non, nơi chuyển thành urobilirubin, do đó không xuất hiện trong nước tiểu trừ trường hợp bệnh lý như các bệnh gan mật, tắt ông dẫn mật.

– Bilirubin gián tiếp: trọng lượng phân tử cao và kết hợp với albumin huyết thanh, không tan trong nước do đó không xuất hiện trong nước tiểu ngay khi có bệnh lý.

– Urobilirubin là sản phẩm cuối cùng của quá trịnh dị hoá bilirubin trực tiếp, 50% thải qua phân, 50% tái hấp thu qua chu trình gan mật, 1 lượng nhỏ 1-4mg/24 giờ vào nước tiểu và thoát ra ngoài.

+ Ly giải máu hay bệnh tế bào gan dẫn đến nước tiểu có màu vàng của mật do tăng urobilirubin niệu.

+ Tắc ống dẫn mật hay loạn khuẩn ruột do kháng sinh làm cản trở sự chuyển đổi bilirubin trực tiếp thành urobilirubin à giảm urobilirubin  niệu.

– Test dipstick phát hiện cả bilirubin và urobilirubin niệu, nhờ kết hợp 2 chất này với muối diazonium làm phát sinh phản ứng màu.

– Âm tính giả: có acid ascorbic do làm giảm độ nhạy

– Dương tính giả: khi có phenazopyridine  niệu do làm màu nước tiểu mà vàng cam tương tự phản ứng sinh màu thuốc thử.

6. Leukocyte Esterase and Nitrite Tests phát hiện vi khuẩn và bạch cầu

– Test dipstick xác định vi khuẩn (nitrit) hay bạch cầu (men leukocyte esterase), sau đó định lượng vi khuẩn bằng phân tích cặn lắng nước tiểu.

– Test Nitrite reductase dựa trên chuyển đổi nitrate thành nitrite do các vi khuẩn đường niệu, đặc biệt nhóm enterobacter. Khi test dương tính số lượng vi khuẩn niệu thường lớn hơn 100.000 vk/ml. Nước tiểu ở lâu trong bàng quang >4h để nitrate biến thành nitrite, do đó test này thường dương tính với mẫu nước tiểu lấy vào buổi sáng (ngay sau khi thức). Tuy nhiên có nhiều yếu tố đưa đến âm tính giả. Khi vi khuẩn có trong đường niệu nhưng không đủ lâu để biến đổi nitrate, hay khi chế độ ăn không có nitrate, hay khi dùng nhiều vitamine C.

– Test leukocyte esterase dựa trên sự hiện diên esterase trong tế bào bạch cầu hạt. Test được chỉ định khi có tiểu mủ. Test chính xác với các BN có bạch cầu niệu 10- 12 BC/quang trường x40 trong mẫu nước tiểu ly tâm. Test chỉ thị tốt cho tiểu mủ, nhưng không chứng tỏ có khuẩn niệu. Do đó, cần kết hợp với test nitrite để phát hiện nhiễm khuẩn niệu và viêm nhiễm. Âm tính giả của test này xảy ra nếu có tiểu đường hay do thuốc phenazopiridine hychloride (pyridium), nitrofurantoin, vitamin C, hay rifampin trong nước tiểu.

IV. PHÂN TÍCH VI THỂ

– Đòi hỏi kinh nghiệm các nhân của BS hay KTV xét nghiệm.

– Nước tiểu buổi sáng và phân tích ngay sau lấy là tốt nhất.

– Các bước chuẩn bị, mẫu cặn lắng nước tiểu:

1	Quay ly tâm 10 ml nước tiểu 2000 rpm/5 phút
2	Gạn bỏ phần nổi bên trên
3	Trích rút lấy 1 ml phần đáy ống
4	Nhỏ 1 giọt lên lame quan sát kính quang trường thấp x10 và sau đó quang trường cao x40

Note: Quang trường x10: độ phóng đại x100 đủ dùng để tìm hồng cầu, bạch càu, trụ, cystine crystals, đại thực bào, và ký sinh trùng (Trichomonas vaginalis và Schistosoma hematobium)

        Quang trường x40: độ phóng đại x400 dùng đẻ phân biệt hình dạng của hồng cầu, các crystal khác, đặc biệt tế bào hình mem bia, vi khuẩn.

– Để có sự tương phản tối đa của những thành phần trong cặn lắng nước tiểu,màng chắn kính cần đặt đúng để tránh chói sáng, và với các thành phần quan trọng như vi khuẩn, mẫu cần được nhuộm màu với xanh methylene.

1. Nhuộm màu

– Thường được nhuộm màu với xanh methylene, theo các bước:

1	Nhỏ giọt nước tiểu trên lame và đợi tự khô
2	Nhỏ thêm vài giọt xanh methylene và để trong 10- 20s
3	Rửa lại với vòi nước  và để tự khô
4	Quan sát lame kính dưới dầu (quang trường kính x100)

– Có thể nhuộm với Gram’s stain, nhưng tốn thời gian và phức tạp hơn, và chỉ ưu điểm hơn khi cần quan sát Neisseria gonorrhoeae (song cầu khuẩn gram âm).

2. Giải thích xét nghiệm

 Phân tích vi thể cần phân tích các thành phần: (1) Tế bào, (2) Trụ, (3) Crystal, (4) Vi khuẩn, (5) Men bia, và (6) Ký sinh trùng.

2.1. Tế bào

2.1.1. Hồng cầu

– Sự hiện diện vài HC trong nước tiểu (tiểu máu) là bất thường và cần được soát.  Các nguyên nhân tiểu máu ít gặp như: chạy bộ đường dài, chảy máu âm đạo, viêm nhiễm cơ quan lân cận hay cơ quan tiết niệu như túi thừa, viêm ruột thừa…

Tiểu máu kết hợp với viêm bàng quang hay niệu đạo thường hết sau khi điều trị. Tiểu máu dai dẳng không triệu chứng ở bất kì độ tuổi nào cần tầm soát tìm nguyên nhân.

– Ở bệnh nhân tiểu máu, phương pháp thu thập 3 bình chứa có thể gợi ý nơi chảy máu.

1	Đưa BN 3 bình chứa có ghi nhãn lọ 1, 2, 3
2	BN lấy nước tiểu 10- 15ml đàu tiên vào bình 1, 30- 40ml tiếp thêo ở bình 2, và 5-10 ml tiếp ở bình 3
3	Dùng phương pháp xét nghiệm vi thể quay ly tâm lấy cặn lắng 3 mẫu nước tiểu quan sát dưới kính hiển vi (có hay không có nhuộm) để tìm hồng cầu.

Nếu HC có ở bình 1 thường chảy máu từ miệng niệu đạo và niệu đạo trước; Nếu HC hiện diện ở bình 3 thường chảy máu từ niệu đạo sau và cổ bàng quang; Nếu HC có bằng nhau ở cả 3 bình thường chảy máu từ trên cổ bàng quang (bàng quang, niệu quản, thận). Lấy các mẫu nước tiểu cần trước khi thăm khám trực tràng tránh sai lệch kết quả.

– Ở bệnh nhân có tiểu máu đại thể thường không dùng test 3 bình chứa vì BN (đặc biệt nam) có thể cho biết dòng nước tiểu lúc nào sậm màu nhất (có nhiều HC).

– Hình thể HC biến dạng có thể là bệnh của cầu thận được Stamey & Kindrachuk (1985) mô tả (hình). Biến dạng HC được cho là có sự thay đổi về độ thẩm thấu và nồng độ cao các thành phần hóa học tác động lên HC khi đi qua ống thận.

2.1.2. Bạch cầu

– Không đồng nghĩa với nhiễm khuẩn niệu, ngay khi có tiểu mủ.

– Kết quả bất thường (tiểu mủ) khi: mẫu cặn lắng nước tiểu giữa dòng ở nam, hay  nước tiểu lấy bằng chọc kim trên xương mu hay ống thông có trên 5BC/ quang trường x40. Nếu BN có triệu chứng nhiễm trùng niệu: tiểu mủ, khuẩn niệu thì thường được chẩn đoán  nhiễm trùng tiểu và khởi đầu điều trị bằng kinh nghiệm. Tuy nhiên, có nghiên cứu các BN nữ với triệu chứng nhiễm trùng niệu, thì có 61% nữ có tiểu mủ nhưng không có vi khuẩn phát triển trong bàng quang từ cách mẫu nước tiểu lấy từ trên xương mu và ông thông (Komaroff, 1984).Do đó cần có bằng chứng về vi khuẩn niệu hiện diện trong nước tiểu qua cấy nước tiểu.

– Lao thận có thể gây tiểu mủ “vô khuẩn” và các BN với tiểu mủ dai dẳng có kết quả âm tính khi cấy nước tiểu. Nhuộm cặn lắng đặc hiệu với  Ziehl_Neelsen có thể chẩn đoán lao thận, nhưng chỉ dương tính khoảng  50% (với mẫu đơn độc) và khoảng 78-80 % với mẫu nước tiểu 24 giờ. Kết quả có thể âm tính giả khi có trong mẫu nước tiểu vi khuẩn cộng sinh mycobacterium smegmatis (đặc biệt ở nam hẹp bao da qui đầu).

– Sỏi niệu, các vật thể lạ trong đường tiểu (ống thông, stent…)có thể gây tiểu mủ, cần được tầm  soát bằng các cận lâm sàng hình ảnh.

2.1.3. Tế bào biểu mô

– Tế bào biểu mô gai trong cặn lắng nước tiểu cho thấy có thâm nhiễm từ niệu đạo trước ở nam và từ miệng niệu đạo nữ.

– Tế bào biểu mô chuyển tiếp không thường gặp trong cặn lắng nước tiểu, nếu có với số lượng nhiều và bất thường về mô học (nhân to, đa nhân, tăng tỉ lệ nhân/bào tương) là dấu hiệu bệnh lý ác tính của niệu mạc (hình).

2.2. Trụ

– Trụ được hình thành từ ống thận xa và ống góp, thông thường không thấy trong cặn lắng nước tiểu, nếu có biểu hiện tồn tại bệnh thận.

– Có trụ bạch cầu trong nước tiểu gợi ý viêm đài bể thận. Trụ bạch cầu cần được phân biệt với trụ tế bào biểu mô bằn cách thêm vào 1 lượng nhỏ acid acetic dưới lame phủ để  tăng chi tiết nhân tế bào (trụ có khuynh hướng tập trung ở phần rìa lame). Khi có lượng lớn trụ BC hay tế bào biểu mô, biểu hiện có bệnh thận, cần được tầm soát. Ở người nhận thận ghép, việc tăng tế bào biệu mô hay trụ có thể là dấu hiệu sớm của thải ghép cấp.

– Trụ hồng cầu đặc trưng bệnh viêm cầu thận hay viêm mạch máu.

– Trụ hyaline có thể hiện diện là 1 hỗn hợp chất nhầy và globulin. Trụ hyaline thường gặp sau hoạt động thể lực và trong mẫu nước tiểu cô đặc hay có acid niệu cao. Trụ hiếm khi gặp ở nước tiểu kiềm, và do đó không thấy trong mẫu nước tiểu lấy ở bệnh nhân đứng lâu, hay mẫu không bị acid hóa.

– Trụ hạt thường nhất gặp trong tế bào biểu mô bị phân hủy, bạch cầu, hay protein, thường là dấu hiệu bệnh ống thận.

2.3. Crystal

– Crystal niệu đơn thuần không là dấu hiệu bệnh lý. Crystal hình thành trong nước tiểu bình thường dưới nhiệt độ phòng.

– Các crystal cystine, leucine, tyrosine, cholesterol, bilirubin, hematoidin, và sulfonamide có trong nước tiểu là dấu hiệu bất thường.

– Việc sử dụng chất ức chế protease điều trị BN nhiễm HIV gây sỏi niệu do sự hình thành crystal indinavir trong nước tiểu, với đặc điểm phẳng, hình chữ nhật, hay thường hình cánh quạt hay hình sao (Gagnon, T soukas & Watter, 1998; Kopp, 1997).

2.4. Nhiễm khuẩn niệu

2.4.1. Phân tich vi thể

– Nhiều vi khuẩn niệu trên 1 quang trường cao (x40) ở mẫu nước tiểu lấy đúng cách (lấy giữa dòng ở nam hay lấy trên xương mu bằng kim hay lấy bằng thông thiểu ở nữ) cho chẩn đoán xác định và điều trị theo kinh nghiệm nên được khởi đầu. Thường dễ phân biệt và đếm vi khuẩn với kính hiển vi x40 và nhuộm mẫu bằng xanh methylene. Kết quả nên được xác định lại bằng cấy nước tiểu.

2.1.2. Cấy nước tiểu

* Chỉ định và giải thích:

– Cấy nước tiểu đặc biệt qua trọng ở BN nhiễm trùng dai dẳng và tái phát, ở BN suy thận hay dị ứng thuốc. Cấy nước tiểu có thể dùng để ước lượng số vi khuẩn trong nước tiểu (cấy đinh lượng), để xác định chính xác vi khuẩn và giúp dùng thuốc hiệu quả hơn trong điều trị nhiễm trùng.

– Phương pháp thu thập nước tiểu, tình trạng mất nước của BN, BN có dùng kháng sinh  ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả cấy.

– Khái niệm nhiễm trùng niệu khi có 10⁵ vi khuẩn/ 1ml không phải tuyệt đối chính xác. Số lượng vi khuẩn ít hơn không thể loại trừ khả năng nhiễm trùng, đặc biệt ở BN có triệu chứng. Có vi khuẩn trong tỷ trọng nước tiểu thấp thì quan trọng hơn nhiều bằng cùng số lượng vi khuẩn ở nước tiểu có tỷ trọng cao.

– Xác định kháng sinh nhạy cảm với vi khuẩn đôi khi không cần thiết như trong nhiễm khuẩn niệu thông thường vì tác nhân 85% do E coli, mà rất nhạy cảm với nhiều kháng sinh uống. Nhưng khi có nhiễm trùng máu, bệnh có suy thận, tiểu đường , hay nghi ngờ nhiễm enterococal, Proteus, hay Pseudomonas,  thì rất quan trọng làm kháng sinh đồ. Theo dõi nồng độ khándg sinh trong máu, trong nước tiểu có thể được chỉ định đặc biệt ở các bệnh nặng, bệnh không dung nạp thuốc.

** Test nhanh tầm soát nhiễm khuẩn niệu: Có 2 hệ thống phát triển phụ thuộc và không phụ thuộc.

– Hệ thống phát triển phụ thuộc:

+ Cho nước tiểu vào ủ trong dịch cấy trong 4 – 12 giờ có thể có kết quả, tốt nhất 12 giờ mới kết luận là âm tính.

+ Có thể dùng cách đo độ dẫn điện: nhưng cách này dương tính giả thường cao

+ Dùng test nitrit và test leukocyte esterase, phát hiện gián tiếp nhanh vi khuẩn.

– Hệ thộng phát triển không phụ thuộc:

+ Hệ thống tự động vi thể với nhuộm màu acridine: rất nhạy và tiên đoán được nhiễm trùng niệu, nhưng tỷ lệ âm tính giả cao và chi phí cao.

+ Test bắt giữ bạch cầu và vi khuẩn qua 1 bộ lọc và nhuộm phần lọc và đọc kết quả: hệ thống này rất nhanh nhưng vấn đề nghẹt màng lọc.

+ Phương pháp nuôi cấy tin tưởng là dùng 1 đĩa kính có chứa eosin-methylene blue agar và agar dinh dưỡng, mẫu nước tiểu được nhỏ và cấy vào trong 24 h: phương pháp dễ thực hiện nhưng có khuyết điểm: (1) Không phải tất cả các vi khuẩn đều mọc trên môi trường trên; (2)  Độ chính xác của tính các colony đang được bàn cãi.

*** Nuôi cấy vi trung lao:

– Nhuộm nước tiểu với Ziehl-Neelsen để phát hiện trực khuẩn lao, nên cấy để định danh và để phân biệt có vi khuẩn thường trú mycobacterium.

2.5. Men bia (Yeast)

–  Hầu hết tế bào men bia trong nước tiểu là Candida albicans, hình oval lõm 2 mặt có thể nhầm với hồng cầu và calcium oxalate crystals, có thể phân biệt qua đặc tính nẩy chồi và dạng sợi nấm.

– Thường gặp trong nước tiểu bệnh tiểu đường hay đồng nhiễm với Trichomonas vaginalis.

2.6. Ký sinh trùng

 – Ở nữ: thường phân tích dịch xuất ở âm đạo tìm nguyên nhân viêm nhiễm vùng niệu sinh dục, các bệnh lây truyền qua đường tình dục… bằng cách soi tươi, cấy…

– Trichomonas vaginalis thường gây nguyên nhân viêm âm đạo ở nữ và có thể gây viêm niệu đạo ở nam.

– Trichomonads  có thể được đọc thấy ở quang truong x10, là các tế bào lớn có roi di dộng nhanh, chuyển động qua quang trường.

2.7. Dịch tiết tiền liệt tuyến khi ấn(expressed prostatic secretion: ESP)

– Cách lấy mẫu XN: Nước tiểu bàng quang (voided bladder urine: VB); Dịch tiết TLT khi ấn (expressed prostatic secretion: ESP)

1	Cho 4 lọ ghi nhãn VB1, ESP, VB2, VB3
2	Rửa sạch bao da qui đầu, miệng niệu đạo với benzalkonium chloride hay hexachlorophene.
3	Lấy 10–15 ml nước tiểu đầu tiên vào VB1, lấy tiếp 15-30 ml vào VB2
4	Xoa nhẹ, ấn TLT lấy mẫu nước tiểu vào ESP
5	Lấy nước tiểu tiếp vào lọ VB3

– 4 lọ trên được chia ra làm các test đại thể + vi thể + nuôi cấy, tìm vi khuẩn và bạch cầu:

+ Nếu chỉ có VB1: viêm nhiễm niệu đạo trước.

+ Nếu có ở VB1, Vb2 và VB3: viêm bàng quang, viêm hệ niệu trên (thận).

+ Nếu có ở ESP và VB3: viêm nhiễm ở TLT.

– Nếu dịch tiết nghi ngờ có N. gonorrhoeae ( màu vàng nhạt), cần nhuộm với Gram’s stain tìm song cầu .

– Nếu dịch tiết màu trắng sữa ở lọ VB1, nhuộm với xanh methylene hay Gram’s stain, tìm trichomonas (tế bào men bia).

– Có viêm màu tinh cấp: phân tích nước tiểu và cây nước tiểu giúp tìm nguyên nhân, thông thường do Chlamydia ở nam trẻ và Ecoli ở nam >35 t.

2.8. Các kết quả khác

– Các artifact cần được phân biệt với bất thường bệnh lý như các mẫu sợi nhỏ, sợi tóc…

V. PHÂN TÍCH CÁC CHẤT KHÁC TRONG NƯỚC TIỂU

1. Test ung thư niệu mạc

1.1. Tế bào học nước tiểu

– Với ung thư tế bào chuyển tiếp grade 2-3: thường tìm thấy các tế bào ung, nhưng với grade thấp khả năng tìm thấy tế bào thâp hơn. Do đó soi bàng quang vẫn là test chuẩn chẩn đoán và tầm soát ung thư bàng quang.

1.2. Test kháng nguyên bướu bàng quang: (Bladder Tumour Antigen)

Tìm kháng nguyên của bướu trong nước tiểu (BTA; Bard Diagnostic Science, Inc, Redmond, WA)

1.3. Test stat kháng nguyên bướu bàng quang.

1.4. Test nuclear matrix protein 22 (NMP22; Matritech, Inc, Newton, MA)

khi có ung thư tế bào chuyển tiếp NMP22 tăng trong nước tiểu.

1.5. Test Aura FDP

– Đo sản phẩm giáng hóa Fibrin/Fibrinogen (Fibrin/Fibrinogen Degradation Products).

– Tế bào bướu BQ sinh ra yếu tố tăng trưởng nội mạch dẫn đến thiếu hụt plasminogen, fibrinogen và các yếu tố đông máu khác, mà chuyển đổi fibrinogen thành fibrin và các sản phẩm giáng hoá khác.

1.6. Hệ thống QUANTICYT

là hệ thống phân tích hình ảnh tế bào dựa trên vi tính, phân tích ngẫu nhiên 50 hình ảnh được chọn, phân tích 100 – 500 nhân, hình dạng DNA.

1.7. Các test khác

2. Xét nghiệm Hormon nước tiểu

– Các hormon tuyến thượng thận: bướu tuyến thượng thận

– Acid vinillylmandelic : Bướu tế bào ưa chrom, bướu nguyên bào thần kinh (Pheochromocytoma and neuroblastoma)

– Metanephrine, epinephrine,và norepinephrine niệu tăng trong bướu tế bào ưa chrom.

3. Phân tích sỏi niệu

– Mẫu nước tiểu 24 h tìm các thành phần tăng bất thường gây sỏi niệu tái phát: calcium, uric acid, oxalate, magnesium, citrate, cystein.

– Test nitroprusside : định lượng cystein trong nước tiểu.

4. Rò tiêu hóa đường niệu

– Đổi màu nước tiểu sau khi dùng các chất chậm hấp thu có màu như phenol đỏ.

– Uống viên nang gelatine có than hoạt tính sau đó lấy nước tiểu có màu đen hay quay ly tâm tìm các hạt than đen.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. “Quá trình tạo nước tiểu ở thận”, Sinh lý hoc tập 2, Trường Đại học Y Hà Nội Bộ môn Sinh lý học, NXB Y học Hà Nội (2005),  tập 2, tr.3-31.

2. Glenn S, Gerber, Charles B.Brendler (2007),”Evaluation of the Urologic Patient: History, Physical Examination, and Urinalysis”, In Walsh PC Campbell’s Urology, WB Sauders, pp. 81-110.

3. Karl J.Kreder, Richard D.Williams (2007), “Urologic Laboratory Examination”, In Smith’s General Urology”, Emil A.Tanagho, pp 46-57.